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专家讲坛 | 袁超(第2期):标准品和标准曲线

日期:2021-04-20

编者导语

首先 ,很是荣幸的邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。为了答谢业内同行的厚爱 ,我们将会在“专家讲坛”栏目中连续宣布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容 ,以飨读者。承接上期 ,本期袁老师为各人带来临床剖析中最焦点的部分标准品和标准曲线的精彩介绍。

作者简介

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袁超博士

现任美国华人临床化学学会主席 ,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位 ,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后 ,主要研究偏向为卵白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱要领开发和应用。

第四节 标准品与标准曲线

任何知识都不是伶仃的 ,就像房顶的瓦 ,一片压着一片。想要揭开其中的一片 ,往往要先揭开旁边的几块儿。如此类推 ,往往不知应该从哪儿开始下手。想来想去 ,决定单刀直入 ,选取最焦点的一块瓦 ,标准品。

临床检测的数据要想测的准 ,离不开一条好的标准曲线。通俗来讲 ,标准曲线就像一把尺子。只有把尺子做准确了 ,才华把未知物品的长度测准确。从科学上来讲 ,标准曲线就是检测物质的浓度和仪器读数的一种线形关系。一般是浓度越高 ,读数越大。标准品的浓度是已知的 ,高中低都有。测完标准品以后 ,把它们的浓度和仪器测得的读数在x/y的坐标纸上一画 ,连一条线就成了。测未知的病人样品时 ,浓度(x)是未知的 ,只有仪器的读数(y) ,通过这条曲线可以把y换算成浓度。

标准品应该怎么做 ,怎么用 ,这里面有许多学问。质谱是新鲜技术 ,大多的检测项目还买不到标准品 ,只能自己配。做标准品需要有纯样品。最好的纯样品应该是浓度和纯度都有包管书的 ,这样用起来定心。如果是液体的溶液就更好了 ,省去自己称量和溶解的麻烦。高浓度的纯样品要稀释到差别的低浓度才华使用。用什么来稀释是下一个很是要害的办法 ,这里面牵扯到基质效应。这个留作以后再讨论 ,因为基质效应这块儿瓦是质谱临床应用里比较难理解的一个看法。

标准品的浓度规模怎么定 ,最高定多高 ,最低定多低 ?这个要凭据临床的需要和实验室的实际情况来定。一般的情况下是标准曲线要笼罩95%病人样品的浓度 ,最好是能笼罩99%的病人。这样只有1%的病人浓度在标准品规模之外。浓度太高的病人样品需要稀释后重做才华出报告的。所以标准品浓度规模大的利益是降低重复率。重复率对病人、对实验室都是一个坏事情。对病人来说 ,延迟了获得结果的时间 ,对实验室来说增加了开支。那么可不可以把凌驾标准品规模的浓度直接出报告 ,不做稀释呢 ?谜底是可以的 ,但有限制条件。最高可以凌驾最高点的50% ,最低可以比最低标准品低50%。为什么是50%呢 ?没有原理 ,是行业共识。这样做的价钱是什么呢 ?是每半年要做一次线性规模的验证。线性规模的验证留到以后再讲 ,横竖每半年需要做这么一次试验 ,还挺麻烦的。为什么是半年呢 ?又是行业共识。以后还会遇到许多的行业共识的工具 ,我就纷歧一点出来了。要想不麻烦 ,那就把标准品规模做宽 ,做得和线性规模一样宽 ,这样就不必每半年做一次验证了。但下一个限制条件就又来了 ,最高的浓度总不可凌驾纯品的浓度吧 ?另外浓度高了 ,用的纯品也就多了 ,价格也就上去了。所以最后浓度规模的选定是凭据多方面的因素综合选定的。

有了最高和最低的浓度 ,中间的怎么办呢 ?放几个点 ,浓度定在哪里 ?定几个点要看最高和最低的浓度的差别 ,相差越大 ,点数越多 ,一般差一个数量级放要三个点。总数一般都是奇数 ,好比五个、七个、九个 ,就像政治局常委和联邦最高法官的数目 ,表决的时候不会骑墙。中间点的浓度既要照顾临床的需要 ,有要便于配置。临床上有病没病的临界点四周要放一个点;浓度最好是等差等比的梯度 ,好比2481632这样的 ,配的时候要容易些。配溶液的基本操作和器皿的选择放到另外的章节再讲。不是每个人的手艺都过关的。用微量移液器(俗称枪)称水的重量 ,做六次 ,CV能到1.5%以内人才有资格去配标准品。

标准品是有保质期的 ,在保质期结束以前要把下一批的标准品做出来。通;岚蚜脚曜计贩旁谝黄鹋 ,再加上1020个病人样品。浓度高和低的病人样品都要有。用新旧的标准品测出来的数据不可差太大 ,最好是TEa1/31/4以内 ,一般是5%10%。TEa留到以后再讲。如果新标准品通过了这个检测 ,下面有两个选择来决定新标准品的浓度。一是用算出来的预期值 ,另一个是用测得的实际值。这里面的细微差别是公婆说理 ,我就不展开讨论了。

标准品是把每个浓度都配出来 ,分装、冷冻 ,照旧就把最高的浓度配出来 ,用确当天再做稀释配其它浓度 ?这里面没有硬性的划定 ,主要看你实验室的冰箱有多大。标准品是一次用完就扔掉 ,照旧可以重复使用直到用光 ?这个也没有划定 ,要看重复使用时 ,样品的稳定性和低浓度的标准品被污染的情况有多频繁。

标准品使用的频率应该怎样定 ?目前为止 ,我看到的都是每批样品都要做一套标准品。这一批跑的标准品不可借到别的批次病人样品里去 ,除非有主管或主任的签字。注意这里我应到了"除非"这个词。这就是综合考虑遵循条例和实际事情情况的反应。按原理是不可这样做的 ,可是如果你知道标准曲线一般不会变来变去 ,其中一条明显是因为重复使用被污染了 ,QC和其它指标都正常时 ,借一条当天洁净的标准曲线就是一个合理的变通选择。虽然 ,这个选择的权利不可下放到普通的实验员手里。

一批样品里可不可以做两条标准曲线 ,选好的哪一条呢 ?没有硬性划定。可是如果跑两次就又一次失败的话 ,这个要领自己就不过硬 ,需要回炉重新加工。如果标准曲线每次变革不大 ,可不可以一条曲线一天内重复使用 ,一个星期之内呢 ?目前还不可以 ?刹豢梢圆槐乇曜记 ,只用内标和内标的浓度来算呢 ?这个想法很新颖 ,但还没有被广泛认可 ,除非是做半定量。

标准品跑出来纷歧建都在一条直线上 ,会有偏差。偏差几多可以接受呢 ?一般是15% ,最低点可以用20%。如果凌驾了这个规模可以去掉吗 ?谜底是可以的 ,可是有限制。每四到五个点可以去掉一个点。如果没有哪个点凌驾15% ,可是QC出去了 ,可不可以去掉一个标准品的点让QC通过呢 ?谜底是不可以的 ,除非有实验室卖力人的签字。色谱峰可以手工调吗 ?谜底是不可以的 ,尤其是内标的峰。被测物质的峰在低浓度时容易被杂峰滋扰 ,手动选峰可以有条件的接受。最低的点可以被排除吗 ?一般不可以 ,除非所有的病人样品都比第二低的点高。同理 ,如果把最高的点给排除了 ,所有高于第二个高点的样品都要重做。

除了每个点的偏差 ,整条线的相关性 (correlation)要大于0.990.995。具体数值从实际结果中来。色谱峰的参数 ,好比保存时间 ,峰宽 ,baseline可以变革吗 ?理论上是不可以的。但在实际应用中 ,随着色谱柱的使用次数增加 ,这些参数都会变。最好是在做要领验证时 ,把这些考虑进去 ,确定旧柱子也能通过要领验证。这样临床时就有心理底气去release旧柱子所爆发的不是很理想的峰的结果。

 

声明:本文章来源“临床质谱网” ,作者:袁超博士 ,大发welcome生物已获得临床质谱网和袁超博士授权 ,如需转载 ,请联系原作者!

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