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专家讲坛 | 袁超(第3期):妥协的艺术-权重

日期:2021-04-20

编者导语

首先 ,很是荣幸的邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。为了答谢业内同行的厚爱 ,我们将会在“专家讲坛”栏目中连续宣布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容 ,以飨读者。承接上期 ,本期袁老师为各人带来标准曲线中权重的精彩介绍。

作者简介

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袁超博士

现任美国华人临床化学学会主席 ,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位 ,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后 ,主要研究偏向为卵白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱要领开发和应用。

第五节 妥协的艺术-权重

理想的情况下 ,所有标准品的点都在一条直线上。但现实情况往往不会这么完美。就像要修一条高铁 ,靠近了这个都会 ,就可能疏远了那个都会。每个点都想高铁从我这里过。怎么取舍 ,怎样选择 ,这就是妥协的艺术。

既然不可满足所有人 ,那就把各人的不满足的总和做到最小就行了。关于标准曲线来说 ,这个要领就叫线性回归(linear regression ,点到线的笔直距离)。实际生活中用的更多的是Deming Regression(点到线的直线距离)。如果你对X的丈量很有信心 ,那就用前者 ;如果X和Y的丈量都没有百分百的掌握 ,就用后者。

目前为止 ,我们对每个点都是一视同仁的。好比公司食堂每周的菜谱 ,每个人都有投票权 ,这叫民主。可是公司业务上的决定就不可这样了。明年上马什么项目是不会过问保安和保洁的。这时候领导的意见就占上风了 ,所谓"位高权重"和"人微言轻"。在标准曲线上 ,这个还真翻译成了权重(weighing factor)。常见的权重是1/X。就好比投票的时候 ,你的票要乘以一个系数 ,这个系数可以是你的人为 ,也可以是你治理的人的数目。这样领导的权重就显出来了。反应在政治生活里 ,就是社会的精英阶层决定社会的走向。在临床检测中 ,这样做也是有意义的。好比你的曲线是从浓度1个单位到100个单位。那么1个单位的偏差关于1来说就是50% ,但关于100来说就只有1%。所以划线的时候虽然要照顾浓度低的点 ,上面的点偏个十个八个单位 ,也关系不大。1/X权重的意思就是每个点到线的距离要乘以1/X、再加和、然后取最小值。如果总统选举也可以加权重(选票乘以你已往四年交的联邦税) ,那些靠吃救济用饭不交税的穷人就没有谈话权了 ,民主党也就没戏了。所以政治是最能体现妥协的运动。参政两院的体制就是个典范。每个州有两名参议员的名额 ,众议员的人数则按你本州的人数多寡决定。一个加权 ,一个不加权。重大事项必须在参众两院都通过才行。这样既照顾了小州 ,又照顾了大州 ,这就是妥协。现在人人都有投票权 ,200年前黑奴是没有投票权。有一阵儿 ,一个黑人有3/5张选票。这也是南方州和北方州的妥协。因为如果不当协 ,那就是战争。与其战争 ,还不如妥协。

另一个常见的权重就是1/X2。这样的话每张选票就不是乘以所得税了 ,而是乘以所得税的平方。这样富人就有更大的决定权了。在政治生活里 ,这个叫寡头 ,国家的命运决定在少数人手里。最极端的情况是由一个点来决定曲线的走向 ,这个叫独裁。1/X2权重反应在标准曲线上 ,就是低浓度的点更有决定性。这个在临床检测上是有意义的。大大都的指标都是低的是好 ,高的不健康。标准曲线的规模往往涵盖了正凡人和病人的常见值。而正凡人往往在这个规模的低端。临床检测最重要的是能把高的正常的值和低的病人的值离开 ,至于很高的值 ,测的准禁绝已经不重要了。好比空腹葡萄糖的100 mg/dL和125 mg/dL有很大区别 ,一个是正常、一个是糖尿 ;但200和250就没有临床意义了。

1/X和1/X2 ,哪一个更好呢?这是一个困扰了我很久的问题。以前选1/X2是理所虽然的 ,因为有专门的文章论述讲1/X2为什么更好。我也就历来没有试过1/X的权重 ;涣说ノ灰院 ,发明标准曲线的权重基本上都是1/X。人越老 ,越没有志气。革新世界的勇气越来越小 ,改变自己适应情况的能力越来越强。单位这么大 ,牛人这么多 ,用1/X肯定有原理。收起自己的疑问 ,慢慢视察。发明除了权重 ,另有好多跟以前纷歧样的地方。这些差别渐渐开始爆发了关联 ,变得有原理起来 ,最后资助自己从差别的角度来认识这个行业 ,这个社会。

1/X2是建立在低浓度能测的很准的基础上了。你给了低浓度那么大的权重 ,如果测禁绝 ,那影响岂不是太大。怎样知道低浓度是不是测的准呢?谜底要从实践中得来。把所有浓度的标准品测十次 ,算平均值和方差 ,再算CV。如果CV从高浓度到低浓度都在5%以内 ,那低浓度给个1/X2的权重是可以的。但如果高浓度的CV不错 ,但低浓度的CV接近10%了 ,那低浓度就不可给它1/X2的权重了。好比拍脑门一天一个主意的领导的话 ,不可太当回事。即便低浓度的CV在5%以内 ,我的建议照旧用1/X。这个5%是在一天内取得的。如果差别的人在差别的日子里做 ,就纷歧定能抵达了。如果真能抵达 ,那你的要领就是好的过头了 ,需要把它人为的降一降 ,以节省本钱。好比用的量变小一些 ,原来用200微升血样的 ,试试100微升 ;原来进样80微升的 ,试试40微升。进的样品量少 ,对仪器的污染就小 ,仪器使用的时间就更长 ;另外残留也会少 ,可以减少重复率。最终的目的都是降低本钱。

低浓度的重复性差是允许的。CLSI里就有这样的论述。标准品的测得值和划定值之间的差别可以在低浓度时摊开一些 ,别的点是15% ,最低的点可以是20%。由于低浓度的点测的不是很稳定 ,所以不可给1/X2的权重 ,1/X是恰如其分的。为什么?有几个原因。1)医院是不会把整管血给公司的 ;它自己要留一些做其它检测项目。所以我们拿到的样品的体积要比医院小。不是每个样品都少。可是我们的要领要尽量照顾体积小的样品(又是权重) ,所以同样的检测要领 ,我们用的样品量要少。量少 ,这就会影响灵敏度 ,尤其是低端的灵敏度 ;2)公司的仪器更老 ,灵敏度更低。一般仪器的寿命是7年。医院财大气粗 ,买新仪器不眨眼睛。公司里凌驾10年的老仪器比比皆是。3)公司的标准曲线规模更宽 ,一般都到99%了?淼睦媸呛堑墓婺4 ,凌驾这个规模的样品就会很少。所以公司用的标准曲线上的低浓度更低 ,高浓度更高。这可以减少样品的重复率(凌驾线性规模的样品 ,需要稀释后再测) ,最终目的是减少本钱。总之一句话 ,公司里要用更差的仪器 ,更少的样品 ,把更低的浓度测出来。听起来似乎很困难。但也不是做不到。具体的要领有许多 ,不是都能说的。1/X是能说的一个。用了1/X ,我们就不倚重最低的点了 ,中浓度的点照旧测的准 ,靠的住的。公司里样品量巨大 ,所以标准品可以用好几个浓度的。医院的量少。一天就20个样品 ,放上11个标准品就显得头大身子小了。一般都是5个点 ,所以每个点都重要。两点总是一条直线 ;三个点谁也说服不了另外两个 ;四个点可以两两作对 ;只有到了五个点 ,才华做到民主 ,协商 ,妥协 ,共赢。公司里每天成百上千的量 ,放11个点做曲线不在话下。在这11个点中 ,最被看重的是中间的7 个点。这七个点是中流砥柱。他们基本决定了标准曲线的走向。但凡有一个反骨 ,直接去掉就行了。这样画出来的曲线 ,延伸到低端也能包管是基本正确的。更况且公司的曲线低端已经低到没有临床意义了 ,放在那儿就是个安排。最是安排的应该是浓度为零的那个点。正常情况下是用不上的。如果它有读数了 ,那说明某种溶液被污染了。这个点好比总统的替身 ;他没事儿 ,就没他的事儿 ;他有事儿 ,那就是出大事儿了。

从上可以看出商业和医院实验室的区别。商业实验室是追求效率和效益的:在满足质量的前提下 ,怎么省钱怎么做 ;医院是直接效劳临床的:精益求精 ,没有最好 ,只有更好 ,要害是让医生兴奋。有时候好到太过的田地了。好比是跳高角逐 ,公司的目的是只要能过杆儿就行 ,再高就是浪费体力 ;医院是要做到比别人更高、更快、更强。如果50以下都是正常 ,公司就会觉得能把10和15区离开是就一种浪费。好比一个子弹打死一个仇人是好 ,三个子弹打死一个仇人就是浪费。我天天琢磨的就是怎么能一个子弹打死仨仇人。

说到权重 ,那就把另外几个跟标准曲线相关的参数也讨论一下吧。首先是过不过原点。一般情况下是不过的。过的话 ,低浓度点的偏差会太大。其中一个原因是本底。没有任何物质的浓度会绝对是零的。好比尼古丁 ,只要你的要领够灵敏 ,它是无处不在的。有了本底 ,标准曲线就无法过零点 ,强制过零点是会出麻烦的。

特殊情况下是可以过原点的 ,好比只有一个标准品的时候。这个标准品和原点连一条线就是标准曲线。这样做在质谱里很是少见 ,但在纯色谱要领里倒是很常见。我觉得原因有四。其一是色谱法多是许多年前建的老要领。那时候没这么多讲究 ,怎么简单怎么来。其二是老要领都很长 ,20-30分钟的很常见。这样的话标准品多了 ,样品做到下班也做不完 ,对效劳临床倒运。第三 ,光吸收做定量的线性很是好 ,不管是向下延伸照旧向上延伸 ,因为它不像质谱 ,有离子化这么个不太有重复性的办法。第四个就是色谱要领特有的 ,叫归零 ,这个在质谱上做不到。就似乎计划盘 ,会的都是老人家 ,年轻人都不会。归零就是在检测要领的最开始强制的把那个时候的光吸收值定为零。这样的话 ,即便有本底 ,也都给归零、看不出了。目前为止 ,还没有哪一家的质谱生产商能做出自动归零的软件。一个标准品加上原点 ,那就没有权重什么事儿了 ,因为怎么画都是两点一线。自动归零延伸出另外一个更神奇的工具 ,那就是流动相可以循环使用!每天不必配流动相了。流动相从柱子流出去 ,经过光吸收的检测池 ,又流回到了装流动相的瓶子里!我第一次看到的时候简直不敢相信自己的眼睛 ,这个老骨董的要领真的好有创意。∫蛭凶远榱 ,所以流动相被污染了也可以用。另外 ,色谱法许多是等梯度洗脱的 ,只有一瓶流动相 ,所以可以重复使用 ,唯一欠好的是要领的时间太长。第三 ,老要领的样品前处理很庞大 ,处理完的样品很是洁净 ,不会有太大污染。现在的色谱仪更先进了 ,可以把出峰的那一段儿分到废液里 ,其它相对洁净的照旧流回到原瓶 ,这样样品就不必处理的那么洁净 ,或者流动相重复使用的次数更多一些。

另有一个有意思的话题是标准曲线究竟是直线照旧曲线。顾名思义 ,应该是条曲线 ,可偏偏大部分情况下 ,它是条直线。有没有弯的标准曲线呢?有。

质谱的线性规模一般在3.5个数量级左右 ,也就是说最高和最低或许差个几千倍。这个在临床上够用了 ,很少有那个被测物在差别人的体内能差一万倍的。可是 ,凡事都有例外。一是人为的没经验 ,为了追求灵敏度 ,样品用的量太大 ,凌驾了质谱的线性规模 ,在高浓度的时候 ,浓度还在往上走 ,可是质谱仪的信号饱和了。电喷雾的时候 ,没有再多的离子可以给你了 ,浓度再高 ,信号也上不去了 ,这时候的标准曲线就要弯了 ,向下弯 A碛杏踔氖橇锥急ズ土 ,出的峰不但高 ,并且头是平的 ,另有fronting。第二种情况比较特殊 ,是离子化的协同效应 ,也就是1加1要大于二。在被测物的浓度升高的时候 ,离子化有叠加的效应。这样浓度升高时 ,标准曲线也会弯 ,可是是反偏向的弯 ,向上弯 A碛幸恢纸馐褪俏阶饔。浓度低的时候 ,被测物被容器吸附了。浓度增高时 ,被吸附的相对减少 ,信号增加的比浓度更快 ,所以向上弯了。第三种情况是有多个被测物保存的情况下 ,为了照顾那个信号最低的 ,把信号高的被测物顶到质谱的线性规模以外了。这个时候的解决步伐就是要人为的降一降那个信号好的 ,好比用个品貌低的离子 ,或者把Q2的碰撞能量加一加 ,等等。最终目的是让各人齐头并进 ,都控制在质谱的线性规模内 ,因为标准曲线照旧直的好。

声明:本文章来源“临床质谱网” ,作者:袁超博士 ,大发welcome生物已获得临床质谱网和袁超博士授权 ,如需转载 ,请联系原作者!

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