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专家讲坛 | 袁超(第6期):离子抑制

日期:2021-05-27

编者导语

很是荣幸邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。我们在“专家讲坛”栏目中连续宣布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容 ,以飨读者。承接上期 ,本期袁老师为各人带来离子抑制的精彩解读。

作者简介

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袁超博士

现任美国华人临床化学学会主席 ,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位 ,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后 ,主要研究偏向为卵白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱要领开发和应用。

第八节 离子抑制

要想理解质谱里的基质效应 ,必须先了解离子抑制。这两个看法有很大的关联性 ,但绝对不是同一回事。就似乎收入和利润的关系 ,都跟挣钱有关 ,但差别照旧相当显著的。

同样量的内标加在差别的样品里 ,最后出来的内标的品貌不尽相同 ,这里面有许多原因。隐藏在其中的一个原因就是离子抑制。要想理解离子抑制 ,咱们先得把其它的原因去除掉。

第一个原因就是LCMS自己的变数。即即是同一个样品 ,好比一个标准品 ,测几遍 ,每遍的结果都不会完全相同。那同一个样品测n遍 ,怎样的CV才算可以接受呢?这个没有统一的划定 ,虽然越小越好。有些检测项目的最大允许误差(total allowable error ,简称TEa)是宣布了的 ,一般在20% 到30%之间。所以同一个样品由差别的人在差别的日子里测n遍 ,一般小于20%的CV是可以接受的。但这个20%包括了人与人 ,天与天之间的差别。连续测同一个样品的CV要远远小于20%才行。我自己的标准是3-6%。3%是优秀 ,6%是及格。这就似乎我总共有20块钱来吃午饭 ,我可以拿出来3到6块花在路费上 ,剩下的钱用来买饭。要是花了15块路费 ,这午餐就很紧张了 ,很容易超支。这样的要领就不要往下做了 ,需要反炉重新优化。

这个3-6%是指浓度 ,或者被测物和内标的比值的CV。如果只算内标峰面积的CV ,我个人认为应该在6-10%之间 ,6%是优秀 ,10%是及格。凭据是什么呢?没有非?蒲У钠揪 ,自己的经验得来的。如果非要找凭据 ,那就是sigma了。20%除以6%是三 ,20%除以3%是六;三个sigma是及格 ,六个sigma是优秀。sigma的算法和意义以后再讨论。内标的CV一般会比【被测物和内标的比值】的CV大一些 ,翻个一番 ,到6%~10%的规模 ,是正常的。这也是我们为什么用内标的初志 ,就是用来消减被测物信号的CV。

同一个样品测n遍 ,内标的CV在10%以内;那同样的量的内标放在差别的病人样品里 ,怎样的CV算合适呢?没有统一的标准 ,你个人认为把10%再翻一番 ,20%。这个值照旧越小越好。能做到10%以内就算好要领了 ,这样的要领上了临床以后麻烦也会少。需要注意一点的是要让仪器预热好了再测 ,要不然的话 ,内标变革过大有可能是仪器还没有稳定造成的。尿液里的身分变革太大 ,很难抵达小于20%的要求 ,可以放宽一些 ,甚至到50%。这样做是合适的 ,因为尿里的浓度已经跟血液浓度没有严格的相关性了 ,定性大于定量 ,除非是24小时尿。如果对尿液浓度的丈量真的要求很高 ,那最好照旧把CV做到20%以内。如果被测物浓度够高或者质谱仪够灵敏 ,那么一个简单的步伐就是稀释。任何的样品 ,不管是血样照旧尿样 ,稀释100倍以后 ,肯定没有离子抑制了 ,内标的CV也会很稳定。

把内标的CV尽量做的小的利益是什么呢?那就是能更好得看到其它的工具。打一个比方 ,坐在摇晃的车里写字 ,车摇晃的厉害了 ,写的什么字就看不出来了。要想看清写的字 ,就要把车的摇晃度给降下来。车开得越稳定 ,越能写更小的字。内标的CV就像车的摇晃度 ,越小才华看见手的细微行动。

CV降下来以后我们要看什么呢?看outlier ,看内标太高或太低的点。如果绝大部分病人的内标都在平均值的上下10%以内 ,那突然有一个点在20% ,那这个点就是outlier。如果内标的CV在40% ,那只有60%以外的点才华算outlier ,就似乎坐在走山路的车里 ,波动得太厉害 ,只能写大字了 ,只能看到很离谱的outlier了。

某个病人样品里的内标太高或太低 ,成了与众差别的outlier ,这是个警告 ,这里面有许多信息 ,有许多原因。内标太高或太低时 ,测得的病人结果有可能是禁绝的。直接把这样的结果送出去是可能会对临床爆发负面影响的。内标outlier的成因可以大致分为两类 ,一类是不可重复的 ,另一类是可重复的。不可重复的有许多原因。第一 ,内标加的体积差池 ,少了或多了。气泡会导致少 ,tip外面多挂一滴会导致高。不小心加了两次内标也会导致高。第二 ,样品的体积差池。加少了会导致内标高 ,加多了会导致内标少。第三 ,进样量差池。加样时要是混进了个大气泡 ,会导致内标减少。这个有时可以从液相的压力曲线上看的出来。第四 ,液相什么地方漏了 ,样品有丧失。一般这种情况下 ,后面的所有的样品的内标都低。以上这几种情况都是不可重复的。一个要领既然已经上临床了 ,那体现肯定是不错的 ,在大部分的情况下 ,是不应该泛起上述的情况的。如果真的泛起了 ,那重复一次还会同样爆发的几率是小之又小。如果真是体积加错了 ,是能检测出来的 ,有时肉眼都能看得出。如果再测一次 ,内标是好的 ,病人结果跟第一次一样 ,那就有可能是LC进样时有了气泡或者哪里漏了。如果第二次的结果跟第一次纷歧样 ,那就再测一次 ,看能不可重复第二次的结果。如果可以 ,那就说明第一次有可能是体积加错了。总之 ,这几种原因导致的内标升高或降低是不可重复的 ,再做一次可能就正常了。

如果再做一次 ,甚至再做两三次 ,内标总是偏高或偏低呢?这就是样品自己引起的了 ,是可以重复的。这里面又分为两个原因 ,一个是离子抑制 ,也就是本节的主题 ,另外一个是滋扰物。离子抑制也是由滋扰物引起的 ,但这个滋扰物是看不见的 ,峰的形状没有异常 ,只是峰面积小了。能看得见的"滋扰物"是会把峰型给搞糟的 ,多了个峰肩或有拖尾?吹募淖倘盼镆院笤偎 ,这里只讲看不见的滋扰物 ,也就是离子抑制。在这种情形下 ,病人的血液里有一种物质 ,可以把内标的信号给抑制掉 ,这就是离子抑制。

离子抑制一般爆发在离子化这一步。离子化是链接色谱和质谱的要害办法。离子化其实是和气化险些同时爆发的。这个历程就像一只水枪包括在一个通了电的吹风机里。被检测物和内标从水枪里出来 ,周围夹裹着吹风机里吹出的热气 ,四周另有高压电。最后的结果是热气把液体蒸发了 ,高压电把分子给离子化了。只有这样 ,赤裸的带电离子才华飞进质谱 ,被检测到。

如果病人的样品里有这么一种物质 ,好比是一种药物或药物的代谢物 ,它正好和被检测物同时从那液相里出来 ,同时被离子化。如果这种物质的浓度够高 ,那么它就会和被检测物以及内标去争抢离子。争抢的结果就是被检测物和内标的离子化不完全 ,爆发的离子少了 ,信号自然就弱了 ,就酿成outlier了。并且这个outlier是可以重复的 ,因为那个药品保存在样品里 ,测几多遍都是那个时候出来 ,跟被测物抢离子。

离子抑制怎样确制止呢?样品稀释一下就可以做到。样品稀释以后 ,一块儿出来的其它物质就被稀释掉了 ,可是内标加的照旧一样多。仇人少了 ,内标的浓度没变 ,争抢离子的战斗就会偏向内标这一方。最后的结果就是内标的峰会升高(但不会高到跟平均值一样的水平 ,因为仇人只是减少了 ,并没有消失) ,可是被测物和内标的比值稳定。也就是测得的结果在考虑到稀释的倍数以后是稳定的。如果稀释后是这样的情形 ,内标向平均值靠拢 ,并且测得的结果稳定 ,那内标减少的原因就是离子抑制。测抱病人的结果是可以出具的。

在用稀释来解决离子抑制的历程中 ,有个很有趣的现象 ,每次都能重复泛起 ,那就是稀释一倍以后的内标会好一些 ,但总达不到预期的水平。好比不稀释的话 ,内标被抑制了50% ,那稀释一倍以后应该是被抑制25%。但实际操作中往往是在30%左右 ,靠近黄金支解的那个比例 ,0.618。它离不稀释的内标值的距离近一些 ,是4;离均值远一些 ,是6。这里面肯定有什么纪律在里面 ,可是我还没有找到令人信服的科学依据。我只能用一个生活中的例子来或许解释一下:没有离子抑制的样品洁净 ,像牛奶;有离子抑制的样品脏 ,像咖啡。把牛奶咖啡混在一起 ,颜色居中 ,但更偏向咖啡一些。就似乎把一滴牛奶滴到咖啡里 ,咖啡照旧咖啡的颜色;把一滴咖啡滴到牛奶里 ,牛奶就会有咖啡色。

在此总结一下本节的内容:

1. 病人样品里的某种物质在离子化时跟被测物竞争 ,导致信号降低 ,造成离子抑制。

2. 离子抑制是可重复的 ,与样品制备无关。

3. 离子抑制是可以用稀释法来消除的。

4. 离子抑制只有在特殊的情况下才有可能会造成定量的偏差。

能通过稀释来解决的离子抑制还不叫"基质效应";基质效应是稀释解决不了的离子抑制。要害的要害 ,是用什么溶液做稀释以及用什么溶液来配标准品。这个留到下一节来讲。

 

声明:本文章来源“临床质谱网” ,作者:袁超博士 ,大发welcome生物已获得临床质谱网和袁超博士授权 ,如需转载 ,请联系原作者!

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