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专家讲坛 | 袁超(第5期):外标及定量要领总结

日期:2021-05-27

编者导语

很是荣幸邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台” 。我们在“专家讲坛”栏目中连续宣布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容,以飨读者 。承接上期,本期袁老师为各人带来外标与定量法总结的精彩解读 。

作者简介

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袁超博士

现任美国华人临床化学学会主席,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任 。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后,主要研究偏向为卵白质组和质谱 。袁超博士最近十年主要从事临床质谱要领开发和应用 。

第七节 外标及定量要领总结

临床质谱这一系列文章是我两年前的夏天写的 。厥后因为种种原因,一直没有再续 。最近这些文章被《临床质谱检测》的小编发明了,转载了他们的推文里 。在此我要谢谢他的欣赏和读者的捧场 。希望各人有什么反响和要求,都可以写在留言里 。

在跟这位小编接触的历程中,我们做了一些学术性的探讨,由此对以前的文章也做了些调解和修改 。我们最近讨论的一个话题是外标法 。小编提到了一些我忽略的知识点,所以我把外标单独写了一节,另外把种种定量的要领总结一下 。再次重申,都是我的一家之言,仅供各人做参考 。你们如果喜欢如下的内容,那要谢谢这位小编约稿的热情和对我的盲点的提醒 。

从科技生长的历史来看,内标要比外标晚 。所以应该是先讨论外标,后讨论内标 。但因为是临床质谱的文章,外标这个看法基本不涉及,所以在以前的章节里,一直也没有提到外标 。那么我们现在就要沿着时间的长河逆流而上,回到还没有液质联用的年代,看一看外标的兴起和衰落,以及剩余到现在的一些奇特用处 。

什么是外标?外标就是独立于病人样品之外的标准品 。而内标是加在病人样品里面的标准品 。在绝大大都的临床检测要领里,好比光吸收和免疫法,是不必内标的,所以外标就是标准品,也没有须要做出外标和内标的区分 。就似乎时区这个看法,在中美之间有差别的使用习惯 。美国有好几个时区,每次开电话集会都要确定究竟是东部时间照旧西部时间 。中国就一个时区,没有须要提醒各人开会是北京时间,说的话就显得有点儿画蛇添足 。

外标与内标的并存和区别使用是在色谱法里最先开始的 。色谱的外标其实也是标准品 。色谱要领可以加内标,也可以不加内标 。如果不加内标,那就是纯外标的要领,这个才是我们溯流而上要寻找的老祖宗 。在纯外标的色谱法里,外标的浓度从低到高都有,上样以后经过色谱疏散,然后流到检测池,爆发一个色谱峰 。色谱峰的峰高或峰面积与浓度成正比,画一条直线就是标准曲线,由此可以去算出病人样品的浓度(图一) 。早期算峰面积的要领很原始:把色谱峰打印在纸上,用剪刀把峰剪下来,然后放到天平上称,用纸的重量代表峰面积 。当我们感伤当年编程用手工在纸带上打孔是多原始时,色谱其实也经历了类似的翻天覆地的变革 。

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图一 外标法定量示意图

色谱要领进化历程中的一个重要里程碑就是内标的引入 。色谱是一条河,弯来弯曲有变数 。内标可以模拟被测物的行为,让定量越发准确 。所以在色谱法里,内标的用法和原理是和质谱法一样的(见上一节) 。也是用被测物和内标的比值来定量(图二) 。但区别在内标的理化性质 。色谱的内标必须要能和被测物在保存时间上离开 。所以色谱的内标不可能是稳定同位素标记的,而是一个类似物,好比加了个甲基或乙;睦嗨莆 。这样在样品前处理时,基本能代表被测物的行为,在色谱洗脱时又能和被测物离开 。色谱的内标一定不可是内源性的 。如果病人的样品里有内标这种化合物,那要领就不稳定了 。有时候好禁止易选了个不错的内标,跟被测物类似,并且体内也没有,但没过几年,内标被FDA批准了,酿成药了,这下有些人的血液里带这个内标了,要领就需要重建了 。

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图二 内标法定量示意图

正是因为色谱法里引进了内标这个看法,才把以前的标准品硬生生的的给改成了外标 。就似乎反向柱的泛起硬生生的把以前的色谱柱改成了正向柱 。在反向柱泛起以前,色谱柱都是正向的;在内标泛起以前,外标是叫标准品的 。

液质联用又是一个大的技术奔腾 。它结合了液相色谱的强大疏散、纯化功效和质谱的无可相比的灵敏度、特异性 。软电离让这两个技术无缝对接,优势倍增,得诺贝尔奖是实至名归 。在液质联用的要领里,同位素内标的使用相当于如虎添翼,让质谱法一跃成为临床检验里的金标准,定量的标杆 。讲到同位素内标,我们才又顺着历史的长河回到了当下,回到了各人都熟悉的定量要领 。可是内标的讨论并没有完全结束 。

有些庞大的要领,被测的物质太多,好比新生儿筛查(简称新筛),我们不可能给每一个被测物找到一个对应的内标 。这个时候一些理化性质相似的被测物就要共享一个内标了,或者共享一条标准曲线了 。这时候的定量就不是很是准确了 。但新筛的正惯例模和不正惯例模区别很大,定量上有些偏差不影响临床的应用 。

新筛要是给每一个被测物做一条标准曲线的话,这个难度很是大 。许多标准品是买不到的 。买到了,稳定性、准确的称量都是个问题 。所以新筛用了个不得已的简单定量要领:被测物浓度即是被测物的峰面积除以内标的峰面积乘以内标的浓度 。这里面有一个假设:内标的离子化水平和质谱信号强弱是和被测物相当的 。注意是相当,不是相等 。只要是相当的,那么用此要领建立的正常值规模就是可靠的 。这样的半定量要领在新筛上用得很普及,对临床的孝敬是有目共睹的 。

像新筛这样完全用内标做定量的要领对内标的稳定性有很高要求 。如果时间长了内标有降解,那么做出来的结果就会偏高,就会泛起假阳性,会有很欠好的结果 。如果因为过了保质期要经常去买内标,价钱贵不说,差别批次间的差别也会影响要领的稳定性 。内标买来以后,怎样坚持、延长它的稳定性,这里面有许多窍门 。经过跟小编商量,考虑到可能有的商业利益冲突,决定照旧不在这里透漏的为好 。

在此总结一下如上讨论过的定量要领 。即用外标,又用内标的要领定量最准确,在色谱和质谱里也最常见 。稳定同位素的内标只能用在质谱里,色谱里的内标是类似物 。类似物内标也可以用在质谱要领里(好比几个被测物共享一个内标,或共享一条标准曲线的情况),但这种定量不可称为全定量,但又比下面的半定量要好 。所以我给它起了个名字叫,叫四分之三定量(共享一条标准曲线 。注意,只有个体厂家的软件允许共享标准曲线)和八分之七定量(共享一个内标,可是有各自的标准曲线 。各人可以自己在实验室试一下,把被测物的内标在软件里交换一下,好比维生素D3的内标换给维生素D2用 。标准曲线和质控的结果都会差一些) 。只用外标,不必内标的质谱要领是老要领,已经被历史所淘汰;只用外标,不必内标的色谱要领还保存,它们被历史抛弃只是时间问题 。只用内标,不必外标的质谱定量要领只是用在个别的项目中,尤其是新筛的项目 。在其它领域的应用还在探索历程中 。对这种定量要领的普遍了解、认可、和接受还没有到来 。这样的要领因为没有标准曲线,所以不是真正意义上的定量要领,只能叫半定量 。这样的要领在差别实验室之间是没有步伐比较定量的,只能比较定性的结果 。

这一节的技术讨论到此为止,最后跟各人分享一个我自己亲历的小故事 。小时候我就是个文学青年,喜欢读小说,也喜欢写点儿工具 ?垂适驴吹礁腥说牡胤,会情不自禁,泪如雨下 。成年以后,心理成熟的多了,也就不那么触景生情了 。厥后接触了医疗效劳这一行,见多了生死,解剖过尸体,心也就更硬了 。但那天不经意的看到一份儿病历,里面夹了一封信,一行一行读下来,不禁潸然泪下 。这是一名护士写的临终纪录,纪录了一名新生儿的最后时光 。专业的白描叙事里,让人如临其境,似乎能看见撒在病床上的阳光,能听见静脉输液的滴答声,不禁叹息生命的软弱和人性的温暖 。那时自己初为人父,更能感同身受,理解做怙恃丧子的切肤之痛 。于伤心处,不忍卒读,掩卷频频,刚刚读完 。我无法重复护士的原话,执法不允许,品德也不允许 。新生儿到生命的最后也没有个名字,就叫baby girl 。就是这个baby girl和她的家人,对我们的新筛要领做出了巨大的、无可相比的孝敬,让我们可以一直有一个可靠的、稳定的要领去造福其他病人 。我要深深谢谢这个baby girl, 也深深谢谢她的家人 。

声明:本文章来源“临床质谱网”,作者:袁超博士,大发welcome生物已获得临床质谱网和袁超博士授权,如需转载,请联系原作者!

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